Calculadora de Ligadura

Categoría: Biología
- 04 de abril de 2025
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ADN Vector

ADN Inserto

Configuración de la Reacción de Ligation

Cantidad Recomendada de Inserto
8.3 ng
0.33 μL de stock de inserto
Cantidad de Vector
50 ng
Usando 1 μL de stock de vector
Relación Inserto:Vector
3:1 (molar)
Óptimo para clonación estándar

Configuración Completa de la Reacción

Componente Volumen (μL) Cantidad Final
ADN Vector (50 ng/μL) 1.0 50 ng
ADN Inserto (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
Buffer de Ligasa de ADN T4 10× 2.0 1×
Ligasa de ADN T4 1.0 400 U
Agua Libre de Nucleasas 15.67 Hasta 20 μL
Volumen Total 20.0

Consejos de Optimización

Basado en sus parámetros de entrada, aquí hay algunas recomendaciones:

  • Para extremos adhesivos 5' con una relación vector:inserto de 1:3, incubar a 16°C durante 4 horas.
  • El tratamiento CIP del vector ayudará a reducir el fondo de auto-ligación.
  • Si la eficiencia de transformación es baja, intente aumentar la relación inserto:vector a 5:1.
  • Para ligaciones de extremos romos, aumente la concentración de ligasa y extienda el tiempo de ligación.
  • Inactivar la ligasa por calor a 65°C durante 10 minutos antes de la transformación para obtener los mejores resultados.

Acerca de la Ligation de ADN

  • La ligación de ADN implica la unión de fragmentos de ADN a través de la formación de enlaces fosfodiéster.
  • La ligasa de ADN T4 requiere ATP y Mg²⁺ para funcionar correctamente (proporcionado en el buffer de ligación).
  • Las ligaciones de extremos adhesivos son más eficientes que las ligaciones de extremos romos.
  • Las relaciones molares vector:inserto típicamente varían de 1:3 a 1:5 para la clonación estándar.
  • Se recomiendan relaciones más altas de inserto:vector (3:1 a 10:1) para ligaciones de extremos romos o inserciones más grandes.
  • La desfosforilación de vectores (usando CIP, SAP, etc.) previene la auto-ligación del vector.
  • Los sistemas de ligasa rápida pueden reducir el tiempo de ligación a 5-15 minutos a temperatura ambiente.

Fórmula para la Cantidad de Inserción (ng):

\[ \text{Insertar ng} = \left( \frac{\text{Vector ng} \times \text{Tamaño de inserción en kb}}{\text{Tamaño del vector en kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Moles de inserción}}{\text{Moles de vector}} \right) \]

¿Qué es la Calculadora de Ligación?

La Calculadora de Ligación es una herramienta que ayuda a los investigadores a determinar la cantidad adecuada de ADN vector y de inserción requerida para una reacción de ligación exitosa. La ligación de ADN es un paso crítico en la clonación molecular, donde un inserto de ADN se une a un vector plasmídico utilizando una enzima llamada ligasa de ADN.

¿Cómo Funciona?

Esta calculadora permite a los usuarios ingresar detalles sobre su vector y su inserto, incluyendo longitud y concentración. Basándose en la relación molar elegida, calcula la cantidad requerida de ADN de inserción para lograr una reacción de ligación óptima.

Características Clave

  • Calcula relaciones molares de vector a inserto para diferentes escenarios de clonación.
  • Soporta tanto relaciones molares estándar como personalizadas.
  • Proporciona recomendaciones para condiciones de ligación basadas en clonación de extremos pegajosos o romos.
  • Incluye consejos de optimización para mejorar la eficiencia de ligación.

Cómo Usar la Calculadora

  1. Ingresa la longitud del vector (bp) y la concentración (ng/μL).
  2. Ingresa la longitud del inserto (bp) y la concentración (ng/μL).
  3. Selecciona la relación molar deseada de vector a inserto (por ejemplo, 1:3, 1:5).
  4. Especifica el volumen total de la reacción (por ejemplo, 20 μL).
  5. Para configuraciones avanzadas, elige la temperatura de ligación, duración, tipo de ligasa y opciones de tratamiento del vector.
  6. Haz clic en “Calcular” para generar la cantidad recomendada de inserto y la configuración de la reacción.

Preguntas Frecuentes

¿Cuál es la relación molar óptima de vector a inserto?

Para ligaciones de extremos pegajosos, generalmente se recomienda una relación de 1:3 o 1:5 de vector a inserto. Para ligaciones de extremos romos, una relación más alta (por ejemplo, de 1:5 a 1:10) puede mejorar la eficiencia.

¿Por qué se recomienda la desfosforilación del vector?

La desfosforilación (usando CIP, SAP o Fosfatasa Antártica) previene la auto-ligación del vector, reduciendo las colonias de fondo no deseadas.

¿Qué condiciones de ligación debo usar?

  • 16°C durante 4 horas – Condición estándar para la ligasa de ADN T4.
  • Temperatura ambiente durante 15 minutos – Adecuado para Quick Ligase.
  • Durante la noche a 16°C – Recomendado para ligaciones desafiantes o clonación de extremos romos.

¿Cómo puedo mejorar la eficiencia de ligación?

  • Asegúrate de tener la relación molar correcta para el vector y el inserto.
  • Usa ligasa de ADN y buffer frescos.
  • Optimiza las condiciones de ligación (temperatura y duración).
  • Confirma la presencia del inserto mediante electroforesis en gel antes de la ligación.

¿Por qué usar esta calculadora?

Esta Calculadora de Ligación simplifica la configuración de reacciones de ligación de ADN, ayudando a los investigadores a determinar las cantidades correctas de vector e inserto para una clonación eficiente. Al automatizar cálculos y ofrecer consejos de optimización, ahorra tiempo y aumenta la tasa de éxito de los experimentos de ligación.